Косметический синтез коллагена in vitro способствует тестированию

Косметический синтез коллагена in vitro способствует тестированию

Принципы обнаружения и технические пути

Коллаген является основным компонентом для поддержания эластичности кожи, и его синтетическая способность напрямую влияет на антиморщинистую и восстановительную функцию кожи. Косметический синтез коллагена in vitro способствует тестированию путем создания модели культивирования фибробластов, моделирования физиологической среды коры кожи, оценки стимулирующего воздействия испытуемых на биосинтез коллагена. Эта система обнаружения исследуется с человеческими кожными фибробластами (HDF) или вечно превращающимися в фибробласты (например, NHDF), и в стандартизированных условиях культивирования (37°C, 5% CO2B, влажность 95%) после вмешательства испытуемых дважды проверяет изменения в синтетической способности коллагена с уровня белка и уровня гена.

Экспериментальная конструкция использует градиент концентрации (обычно с тремя группами дозы 0,01%, 0,1%, 1%), синхронизируя пустой контроль (без питательной среды сыворотки) и положительный контроль (вишенг C 100 мкмоль / л), чтобы обеспечить сопоставимость и надежность результатов. Ключевые технические принципы основаны на том, что фибробласты, стимулируемые активными ингредиентами, повышают экспрессию гена COL1A1, активируя сигнальный путь TGF - β / Smad, чтобы стимулировать секрецию коллагена I типа. Тестирование требует синхронизации с цитотоксической проверкой (метод МТТ), которая требует, чтобы испытуемый имел выживаемость клеток > 80% при эффективной концентрации, исключая размножение клеток или нарушение результатов теста токсичностью.

Основные методы тестирования и стандартизированные процессы

Уровень белка: определение содержания коллагена типа I методом ELISA

Концентрация коллагена типа I (COL1) в очищающей жидкости, культивируемой клетками с помощью ферментативного метода иммуноадсорбции (ELISA), строго соответствует техническим спецификациям GB / T 35828 - 2018 « Руководство по тестированию эффективности 3D - модели кожи вне тела косметики». Конкретные шаги включают:

Предварительная обработка образцов: сбор клеточной жидкости для очистки в течение 72 часов, 4 ° C 12000 rpm центрифуга в течение 10 минут для удаления примесей;

Пакеты антител были: 96 - пористые пакеты были обработаны крысами против моноклонального антитела COL1 человека (разбавлены 1: 1000), инкубация при 4°C на ночь;

Антигенное связывание: добавьте градиентный разбавленный образец и стандартный продукт (0 - 200 нг / мл), инкубация при 37°C в течение 2 часов;

Цветовая реакция: последовательное добавление маркированного HRP двойного сопротивления (1: 2000 разбавления) и TMB - субстрата для измерения поглощения на длине волны 450 нм после окончания реакции;

Расчет данных: Конвертирование концентрации COL1 по стандартной кривой, экспериментальная группа и контрольная группа сравнивают расчет относительной скорости синтеза, требуя, чтобы содержание COL1 в группе с положительным результатом было на 20% выше, чем у пустого контроля (p < 0,05).

Проверка уровня генов: Real - time PCR для определения экспрессии COL1A1

Чтобы выявить молекулярный механизм синтеза коллагена, необходимо использовать флуоресцентную дозу PCR (qPCR) в реальном времени для обнаружения изменений уровня транскрипции гена COL1A1, экспериментальный процесс выглядит следующим образом:

Общее извлечение РНК: крекинг клеток методом тризола, Nanodrop измеряет концентрацию РНК (соотношение A260 / A280 1.8 - 2.0);

Реакция обратной транскрипции: синтез cDNA с использованием набора реагентов PrimeScript RT при температуре 37°C 15 минут и 85°C 5 секунд;

qPCR - амплификация: с GAPDH в качестве эндогена, последовательность экстрактов COL1A1 F: 5 '- GAGGCCAAGAAGAACATC - 3', R: 5 '- CAGATCACGCACAAC - 3', расширенная в системе LightCycler 480 (предегенерация 95°C 10 минут, 40 циклов: 95°C 15 секунд, 60°C 30 секунд);

Анализ результатов: при расчете относительной экспрессии COL1A1 методом 2 ^ (- дельта - Ct) положительный испытуемый должен повысить экспрессию гена в 1,5 раза и соответствовать тенденциям изменения уровня белка.

Контроль качества и критерии оценки результатов

Контроль качества экспериментальной системы

Гарантия качества клеток: с использованием логарифмических клеток 3 - 10 - го поколения, плотность вакцинации контролируется на уровне 5×10 ⁴cells / cm², обеспечивая клеточную стенку > 90%;

Стандартизация реагентов: сыворотка коровьего скота должна пройти тест на микоплазму, концентрация фермента поджелудочной железы строго контролируется на уровне 0,25%, добавление EDTA 0,02%;

Требования к точности прибора: колебание температуры в инкубаторе для культивирования CO2°C ±0,1°C, поддержание pH 7.2-7.4. Сверхчистый рабочий стол должен достигать уровня чистоты ISO 5 (взвешенные частицы 3520 / м³);

Методологическая проверка: точность RSD < 8% в партии по методу ELISA, точность RSD < 12% в партии, скорость восстановления 90% - 110%; Эффективность усиления qPCR 90% - 110%, коэффициент корреляции R² > 0,99.

Порог определения результата

Основополагающий критерий определения: Субъект может быть признан положительным при не клеточной токсичной концентрации (выживаемость > 80%) при соблюдении любого из следующих условий:

Содержание коллагена типа I увеличивается на ≥20% по сравнению с пустым контрастом (метод ELISA, p<0.05);

Улучшение экспрессии гена COL1A1 в 1,5 раза (метод QPCR) p<0.05)。

Требования к усиленной проверке: Продукты, которые утверждают, что « значительно способствуют синтезу коллагенов», должны одновременно удовлетворять увеличению уровня белка на 30% и повышению уровня гена в два раза, а также предоставлять повторяющиеся данные по крайней мере трех независимых экспериментов.

Технические преимущества и гарантии соответствия

Аппаратные средства и технические возможности

Центр тестирования оснащен лабораторией биобезопасности третьего уровня, основное оборудование включает:

Полностью автоматизированная система культивирования клеток (Thermo Scientific Heracell VIOS): мониторинг температуры и концентрации CO2C в режиме реального времени и сигнализация.

Высокопроизводительная рабочая станция ELISA (BioTek 800TS): Поддержка одновременного обнаружения 96 образцов с ограничением 0,1 пг / мл;

Флуоресцентный количественный PCR (Roche LightCycler 96): оснащен быстрым нагревательным модулем, один эксперимент может быть выполнен за 2 часа;

Система визуализации клеток (Olympus IX73): количественный анализ интенсивности иммунной флуоресценции коллагена в сочетании с программным обеспечением ImageJ.

Квалификация и доверие к данным

Лаборатория аккредитована CNAS (номер сертификата CNAS L22006) и квалификация CMA, и процесс тестирования строго соблюдается:

Национальный стандарт: GB / T 35828 - 2018 « Руководство по тестированию косметических моделей кожи вне тела»;

Международные спецификации: OECD TG 439 "Тест на раздражение кожи in vitro", ISO 10993 - 5 "Тест на клеточную токсичность";

Отраслевое руководство: Китайский центр обзора косметики « Руководящие принципы оценки декларируемой эффективности косметики» (издание 2021 года).

Услуги по индивидуальному тестированию

Полная цепочка технической поддержки для различных типов косметики:

Сырьевой скрининг: экстракты растений, выигрышные пептиды и другие эффективные компоненты для предварительного скрининга экстракорпоральной активности, сокращение цикла исследований и разработок;

Оптимизация формулы: оценка влияния консервантов, ароматизаторов на синтетическую активность коллагена, оптимизация схемы репликации;

Проверка стабильности: хранение в течение 28 дней при 4°C, 25°C и 40°C для мониторинга воздействия разложения активного ингредиента на эффективность;

Услуги по добавленной стоимости данных: предоставление глубокой интерпретации данных, такой как анализ генетических путей COL1A1 и вычисления активных ингредиентов IC50 / EC50.

Применение в промышленности и типичные случаи

Проверка антивозрастной эссенции с помощью этой системы обнаружения показала, что через 48 часов после вмешательства группы концентрации 1% секреция волокнистых клеток COL1 увеличилась на 42,3% по сравнению с пустым контролем (p < 0,01), экспрессия мРНК COL1A1 была увеличена в 2,1 раза, а выживаемость клеток достигла 91,7%. Данные успешно поддерживают его заявление об эффективности « содействия синтезу коллагена», и соответствующий отчет об испытаниях был одобрен Национальным управлением фармацевтики Цзяна в качестве основы для регистрации. Практика показывает, что стандартизированные тесты на синтез коллагена in vitro могут эффективно заменить традиционные эксперименты на животных, гарантируя точность тестирования, значительно снижая затраты на исследования и разработки и этические споры, обеспечивая научную и надежную техническую поддержку для оценки эффективности косметики.