Тест на противовоспалительную эффективность косметики

Тест на противовоспалительную эффективность косметики

Принцип обнаружения и построение экспериментальной модели

Анализ противовоспалительной эффективности косметики in vitro основан на модели воспаления макрофагов, индуцированного липидом (LPS) для оценки ингибирующего воздействия испытуемых на высвобождение воспалительных факторов путем моделирования патофизиологических процессов воспалительных реакций на кожу. В качестве модельной клетки был выбран мононуклеарный макрофаг мыши RAW 264.7, который при стимуляции LPS активирует сигнальный путь NF - Каппа B и выделяет большое количество воспалительных сред, таких как оксид азота (NO), интерлейкин - 6 (IL - 6) и фактор некроза опухоли - α (TNF - α), уровень высвобождения которых положительно коррелирует со степенью воспаления.

Ключевые параметры построения модели:

Плотность клеточной вакцинации: 5 × 10 ⁴ cells / отверстие (96 диафрагма)

Концентрация стимуляции LPS: 1 мкг / мл (Sigma - Aldrich L2630)

Время обработки испытуемых: комбинированная стимуляция LPS после 2 ч предварительной обработки

Положительный контраст: десаи мисон (1 мкмоль / л, ингибитор ≥ 80%)

Эксперимент должен установить 5 градиентов концентрации (0,01% - 1%) и пустую контрольную группу для проверки выживаемости клеток > 80% с помощью метода MTT, чтобы гарантировать, что результаты не будут нарушены клеточной токсичностью.

Основные контрольные показатели и методологическая проверка

Определение выбросов оксида азота (NO)

Для количественного определения содержания NO - метаболитов нитритов в клеточной жидкости используется метод окраски реагента Griess (Sigma - Aldrich G4410). Процесс проверки включает:

Предварительная обработка образцов: взятие 50 мкл клеточной жидкости для очистки и смешивание равнообъемного реактива Griess

Условия инкубации: светозащитная реакция 37°C 15min

Прибор для измерения поглощения на длине волны 540 нм (Thermo Multiskan FC)

Метод расчета: выведение концентрации NO по стандартной кривой субxiao натрия (0 - 100 мкмоль / л), коэффициент подавления воспаления = (среднее значение группы моделей - среднее значение группы испытуемых) / (среднее значение группы моделей - среднее значение пустой группы) × 100%

Методологические требования к проверке: Стандартная кривая R² > 0,99. Точность RSD < 5% в течение дня, коэффициент восстановления 90% ~ 110%.

Обнаружение уровня воспалительных факторов (IL - 6 / TNF - α)

Применяется метод ELISA с двойным заполнителем антител (R & D Systems Backet) со следующими параметрами:

Диапазон обнаружения IL - 6: 7,8 ~ 500 пг / мл, максимальный предел обнаружения 3,9 пг / мл

Диапазон обнаружения TNF - α: 15,6 ~ 1000 пг / мл, максимальный предел обнаружения 7,8 пг / мл

Шаг действия: разбавление образца → инкубация с добавлением проб → стирка пластины → ферментативный стандарт II - анти - связывание → цвет (TMB - субстрат) → реакция прекращения (2mol / L H2SO) → 450 нм показания

Требования к данным: уровни IL - 6 / TNF - α в испытуемой группе были на 30% ниже, чем в модельной группе, и разница имела статистическое значение (независимая выборка t теста, p<0.05)

Стандартная основа и система контроля качества

Тестирование проводилось в строгом соответствии с OECD TG 442E (2018) « Метод наружного тестирования раздражающей / коррозионной кожи» и GB / T 35892 - 2018 « Метод тестирования раздражающей 3D - модели кожи вне тела косметики». Ключевые меры контроля качества включают:

Сертификация клеточной линии: с использованием идентифицированных STR клеток RAW 264.7 (ATCC TIB - 71), количество поколений контролируется в пределах 20 поколений

Отслеживание реагентов: активность эндотоксина LPS ≥1×10 ⁶EU / mg, коэффициент вариации в комплекте ELISA < 10%

Экологический контроль: инкубатор для культивирования CO2C (37°C ± 0,5 °C, 5% CO2C), сверхчистый рабочий стол (уровень ISO 5)

Эффективность данных: 3 комплексных отверстия на концентрацию, эксперимент повторяется 3 раза, коэффициент вариации в группе < 15%

Критерии определения процессов и результатов

Полный экспериментальный процесс

Готовность клеток: восстановление клеток RAW 264.7, передача культуры с помощью питательной среды DMEM, содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота

Обработка испытуемых: разбавление образцов косметики питательной средой до заданной концентрации, стерилизация с помощью фильтра 0,22 мкм

Воспалительная индукция: добавьте LPS (конечная концентрация 1 мкг / мл) для стимуляции 24 ч и сбора эпиклеточной жидкости

Обнаружение индикаторов: синхронное измерение NO (метод Грисса) и IL - 6 / TNF - α (метод ELISA)

Анализ данных: статистический анализ с использованием GraphPad Prism 9.0 для расчета значения IC ₅

Критерии определения результатов

Примечание: Для определения эффективности требуется одновременное соблюдение коэффициента подавления NO ≥ 50% и коэффициента подавления IL - 6 / TNF - α ≥ 40%

Проверка технических возможностей учреждений

Лаборатория CNAS имеет аккредитацию CNAS (номер сертификата CNAS L22006) и имеет надежную технологическую платформу для тестирования на противовоспалительные препараты in vitro, включая:

Многофакторная система обнаружения: Luminex xMAP 200 (может одновременно обнаруживать 10 воспалительных факторов)

Высококачественный визуализатор: PerkinElmer Operetta CLS (клеточный морфологический анализ)

Автоматизированная рабочая станция: Beckman Biomek 4000 (предвыборная обработка)

За последние 3 года лаборатория завершила более 500 партий косметических противовоспалительных тестов, охватывающих кремы, эссенции, маски и другие дозированные формы, скорость прохождения данных 92,3%. Типичный случай показывает, что успокаивающая эссенция, содержащая экстракт портулака, имеет коэффициент подавления NO 62,7% при концентрации 0,5% и коэффициент подавления IL - 6 58,3%, что превосходит средний уровень по отрасли (коэффициент подавления NO 41,2%).

Сценарии применения и отраслевая ценность

Экстракорпоральное противовоспалительное тестирование в основном используется для проверки эффективности чувствительных мышечных протезов, противооспенных и послесолнечных косметических средств, может предоставить предприятиям следующую техническую поддержку:

Оптимизация формулы: скрининг наиболее jia добавок противовоспалительных активных ингредиентов (например, глюкозид, красная мирра)

Заявленное соответствие: удовлетворяет требованиям обнаружения « успокаивающей » эффективности в « Кодексе оценки декларируемой эффективности косметики»

Конкуренция на рынке: Повышение конкурентоспособности продукции с помощью данных сторонних испытаний, например, международный бренд повышает премию на 20%

С улучшением требований потребителей к безопасности косметики, наружное противовоспалительное тестирование стало основным пунктом оценки эффективности. Лаборатория рекомендует предприятиям внедрить этот тест на этапе разработки продукта, в сочетании с испытанием на пятно человека, чтобы сформировать полную цепочку доказательств, как для обеспечения соответствия продукта, так и для повышения доверия к рынку.