Набор реагентов FITC - Annexin V / PI для цитопатии

Набор реагентов FITC - Annexin V / PI для цитопатии

Номер товара:Ф6012Л

Спецификации продукции:100Т

Условия хранения:

4℃Избегайте светового охлаждения, не замораживайте.Срок годности см. наружную упаковкуА.

Спектральные характеристики:

FITC-Аннексин V: Ex/Em = 494/518 нм

PI: Ex/Em = 535/617 нм (с ДНК)

Презентация продукции:

ФИТК-Аннексин V/ПИНабор опадающих реагентов предлагает быстрый и простой способ маркировать клетки раннего опадения (зеленый) и некроза или позднего опадения(Красный) обнаруживает уровень апоптоза клеток. Продукты могут быть протестированы с помощью проточных цитометров или других приборов флуоресцентного контроля.

Приложение V(Мембранный связывающий белок- ВЭто молекулярная масса35-36КДАКа2 +Зависимость от фосфолипидных связывающих белков (ПС) Избирательное сочетание.Фосфолипиды (ПСРаспространяется преимущественно на внутренней стороне клеточной мембраны, то есть на стороне, прилегающей к клеточной плазме. На ранних стадиях отмирания клетки, различные типы клеток принимают фосфатКислород переворачивается на поверхность клетки и подвергается воздействию внеклеточной среды. В этот момент используйте зеленый флуоресцентный зонд.ФИТКОтметитьПриложение VА именноFITC - приложение V，Перевернутый фосфат (ПСВ сочетании с проточным цитометром или флуоресцентным микроскопом можно непосредственно обнаружить экстенсию фосфатила, важную особенность отмирания клеток.Чун. Для некроза или позднего отмирания клеток, поскольку целостность клеток была нарушена,FITC - приложение VМожно попасть в плазму и находиться внутри фосфатного слоя.ПССочетание, которое также делает некротические клетки зеленой флуоресценцией.

Иодид (Йодид пропида, ПИ) Это своего родаДНКВ сочетании с красителем он может окрашивать некротические клетки или тонкие клетки, которые теряют целостность клеточной мембраны на поздней стадии апоптоза.Клеточное ядро.ПИМожет быть488、532 Или546 нмЛазерное возбуждение, показывающее красную флуоресценцию.

Инструкция по применению:

1. Экспериментальное проектирование:

Пустая трубка: клетки отрицательной контрольной группы, без добавленияФИТК-Аннексин V/ПИ. Используется для регулирования напряжения.

Монокластическая трубка: положительная контрольная группа клеток, только плюсFITC-приложение V/Только плюсПИ.Для корректировки компенсации.

Тест - трубка: обработанные клетки, плюсФИТК-Аннексин V/ПИ. После регулировки компенсации напряжения пустой трубкой и монохроматитой получаем необходимые потоковые данные.

2. Сбор клеток:

(1) Для взвешенных клеток:

а.После цитопатической стимуляции1000 об/минЦентрифугирование5 минутВыбросить очищение, собрать клетки, использоватьПБССлегка взвесите клетки и посчитайте. Примечание:ПБСНевозможно опустить тяжесть,ПБСПроцесс повторной суспензии также играет роль промывки клеток, что гарантирует последующую деятельность.FITC-приложение VСочетание.

b.取5×104 - 1×105Перевисевшая клетка,1000 об/минЦентрифугирование5 минутОтказаться от Цин, присоединиться100 мкл 1×Аннексин VСоедините буфер, чтобы слегка взвесить клетки.

с.присоединиться5 мкл FITC-Аннексин VСлегка смешать.

d.присоединиться5 мкл ПИКрасильная жидкость, слегка смешанная.

е.Комнатная температура( 20-25ºС )Светоизоляционная инкубация10 - 15 минут. Можно использовать алюминиевую фольгу, чтобы избежать света. Во время инкубации можно восстановить клетки.2 - 3Для улучшения эффекта окраски.

(2) Для клеток, прикрепленных к стенке:

а.Введите клеточную питательную жидкость в подходящую центробежную трубку,ПБСМойте стенные клетки один раз и добавьте соответствующее количество клеточного пищеварительного раствора(безЭДТА)Пищеварительные клетки. При комнатной температуре инкубация до мягкого дутья может привести к удалению клеточного пищеварительного раствора, когда клеточная стенка сдувается. Чрезмерного пищеварения, которого следует избегать. Примечание: Для клеток, прикрепленных к стенке, этапы пищеварения имеют решающее значение. Если время переваривания слишком короткое, клетке нужно сильно надувать, чтобы упасть, легко вызвать повреждение клеточной мембраны, что приводит к ложному положительному некрозу клетки; Если время пищеварения слишком велико, оно также может вызвать повреждение клеточной мембраны и ложноположительный некроз клеток, и даже может повлиять на фосфатилил на клеточной мембране иFITC-приложение VСочетание, таким образом, мешает обнаружению клеточного апоптоза.

b.Добавьте клеточную культурную жидкость, собранную на предыдущем этапе, и слегка сдувайте клетки и перемещайте их в центробежную трубку,1000 об/минЦентрифугирование5 минутВыбросить очищение, собрать клетки, использоватьПБССлегка взвесите клетки и посчитайте. Примечание: Добавление клеточной питательной жидкости на предыдущем этапе очень важно, с одной стороны, для сбора уже взвешенных клеток, которые умирают или некротируются, а с другой стороны, сыворотка в клеточной питательной жидкости может эффективно подавлять или нейтрализовать остатки. Остатки перевариваются и разлагаются.FITC-приложение VЭто приводит к неудачному окрашиванию.

с.取5×104 - 1×105Перевисевшая клетка,1000 об/минЦентрифугирование5 минутОтказаться от Цин, присоединиться100 мкл 1×Аннексин VСоедините буфер, чтобы слегка взвесить клетки.

d.присоединиться5 мкл FITC-Аннексин VСлегка смешать.

е.присоединиться5 мкл ПИКрасильная жидкость, слегка смешанная.

f.Комнатная температура(20-25ºС)Светоизоляционная инкубация10 - 15 минут. Можно использовать алюминиевую фольгу, чтобы избежать света. Во время инкубации можно восстановить клетки.2 - 3Для улучшения эффекта окраски.

3. Анализ результатов:

(1) Тестирование проточным цитометром:

А. После завершения инкубации можно непосредственно добавить 400 мкл L 1×Annexin V в сочетании с буферной суспензионной клеткой, которая сразу же обнаруживается на борту, FITC - Annexin V возбуждается лазером 488 нм, обнаруживая спектр флуоресцентной эмиссии на 530 нм (канал FITC), а спектр излучения PI - канала составляет около 617 нм.

b. На диаграмме дисперсии двухпеременного проточного цитометра в левом нижнем квадранте показаны живые клетки, которые являются (FITC - Annexin V - / PI -); Нижний правый квадрант представляет собой раннюю опадающую клетку (FITCAnnexin V + / PI -); Верхний правый квадрант - это некроз и поздний апоптоз клеток, как (FITC - Annexin V + / PI +); Левый верхний квадрант показывает голые ядерные клетки, как (FITC - Annexin V - / PI +).

(2) Обнаружение с помощью флуоресцентной микроскопии:

a. 1000 rpm центрифуга 5 мин, собирая клетки и слегка взвинчивая клетки с помощью 400 мкл 1× Annexin V в сочетании с буфером. После переноса клетки в пластину с 96 отверстиями на мгновение или нанесения клеточного мазка их можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом.

В FITC - Annexin V можно использовать фильтр, подходящий для FITC, а в PI - фильтр, подходящий для Cy3 или Texas.

Внимание:

1. Перед использованием, пожалуйста, мгновенно центрифугируйте продукт до основания трубы, а затем проведите последующие эксперименты.

2. Чтобы уменьшить процесс отмирания клеток, инкубационный процесс может работать на льду, но время инкубации может быть увеличено по крайней мере до30 минутА.

3. Поскольку отмирание клеток является быстрым процессом, рекомендуется, чтобы образцы были окрашены после окрашивания.1 часВнутри проводится анализ.

4. Для клеток, прикрепленных к стенке, пищеварение является ключевым шагом. При наличии плавучих клеток, вызванных клеточным увяданием, необходимо собрать плавучие клетки и клеточные клетки, прикрепленные к стенке, и затем объединить окраску. При работе с клетками, прикрепленными к стенке, будьте осторожны и старайтесь избегать искусственного повреждения клеток. Время переваривания слишком короткое, клетки должны сильно дуть, чтобы упасть, легко вызвать повреждение клеточной мембраны,ПИЧрезмерное потребление; Длительное пищеварение, клеточная мембрана также подвержена повреждениям, может даже влиять на фосфатилил на клеточной мембране иFITC-приложение VСоединение. После того, как пищеварение будет покрыто днищем диафрагмы, он будет полностью контактировать с клеткой при легком качании, а затем вылить большую часть, используя оставшееся небольшое количество, а затем переваривать в течение некоторого времени, пока межклеточный разрыв не увеличится, дно бутылки будет цветочным пятном, чтобы закончить. Старайтесь не использовать его в пищеварительной жидкости.ЭДТАА,ЭДТАЭто повлияет.Приложение VАПССочетание.

5. После того, как стенные клетки перевариваются, рекомендуется восстановить около в питательных условиях и средах30 минутПосле окрашивания избегайте ложноположительного.

6. Чтобы избежать потери клеток при промывке, можно использовать большие при всасывании.СоветМаленький на голову.СоветНасос для головы.

7. Концентрация использования красителя определяется конкретными экспериментальными требованиями.

8. Флуоресцентные красители имеют проблемы с закалкой, в процессе сохранения и использования, пожалуйста, обратите внимание, чтобы избежать света, чтобы замедлить закалку флуоресценции.

9. Для вашей безопасности и здоровья, пожалуйста, наденьте лабораторный костюм и используйте одноразовые перчатки.