YAC - 1 Клеточная среда

Оперативные элементы:

Этапы клеточной культуры:

I. Подготовка питательных сред и условий замораживания культур:

1) Подготовка среды DMEM - H (с добавлением NaHCO3 1.5 г / л), 90%; Сыворотка плода крупного рогатого скота, 10%. В зависимости от экспериментальных потребностей можно также выбрать взвешенные питательные среды для роста 293Т - клеток.

2) условия культивирования: газовая фаза: воздух, 95%; Углекислыйгаз, 5%. Температура: 37 градусов Цельсия, влажность инкубатора 70% - 80%.

3) Замороженная жидкость: 90% питательной среды, 10% DMSO, в настоящее время используется в существующем распределении. Хранение жидкого азота.

II. Клеточная обработка:

1) Реанимационные клетки: замороженные трубки, содержащие 1 мл клеточной суспензии, быстро размораживаются и размораживаются в водяной ванне при температуре 37°C, добавляя 4 мл питательной среды, смешанной равномерно. Центрифугирование в течение 4 минут в условиях 1000RPM, удаление очищающей жидкости, добавление 1 - 2мл питательной среды после дутья. Затем все клеточные суспензии добавляются в бутылку для культивирования на ночь (или клеточная суспензия добавляется в чашку Петри 10 см, добавляется около 8 мл питательной среды, культивируется на ночь). На следующий день поменяйте жидкость и проверьте плотность клеток.

2) Клеточная транскрипция: если плотность клеток достигает 80% - 90%, можно проводить культуру транскрипции.

Для клеток, прикрепленных к стенке, транскрипция может ссылаться на следующие методы:

1. Выбросить культуру верхней очистки и промыть клетки 1 - 2 раза с помощью PBS, который не содержит ионов кальция и магния.

2. Добавьте 2 мл пищеварительного раствора (0,25% Trypsin - 0.53 мм EDTA) в питательную бутылку, поместите в инкубатор 37°C для переваривания в течение 1 - 2 минут, затем под микроскопом наблюдайте пищеварение клетки, если большая часть клетки округлится и выпадает, быстро возьмите операционный стол, постучите несколько раз в питательную бутылку и добавьте небольшое количество питательной среды, чтобы прекратить пищеварение.

3. Нажмите 6 - 8 мл / бутылку, чтобы добавить питательную среду, мягко выровнять и высосать, в условиях 1000RPM центрифугировать в течение 4 минут, отбросить очищающую жидкость, добавить 1 - 2 мл питательной жидкости после дутья равномерно.

Разделите клеточную суспензию в новую чашку или бутылку, содержащую 8 мл питательной среды, в пропорции от 1: 2 до 1: 5.

3) Замораживание клеток: Когда клетки растут в хорошем состоянии, может проводиться замораживание клеток. Когда прикрепленные к стенке клетки замораживаются, после удаления питательной среды добавляется небольшое количество, после того, как клетка становится круглой, добавляется около 1 мл сывороточной среды после добавления в трубку замораживания, а затем добавляется 10% DMSO для замораживания.

Как заморозить клетки?

Метод замораживания и хранения 1: охлаждающая трубка помещается при температуре 4°C 30 ~ 60 минут → (20°C 30 минут *) → - 80°C 16 ~ 18 часов (или на ночь) → резервуар жидкого азота vaporphase для долгосрочного хранения.

Второй способ замораживания и хранения: охлаждающая трубка помещается в программируемый охладитель с установленной процедурой ниже 1 - 3 °C в минуту до - 80 °C, а затем помещается в резервуар для жидкого азота vapor phase для долгосрочного хранения. 20°C не может превышать 1 час, чтобы предотвратить слишком большие кристаллы льда, вызывая массовую гибель клеток, или пропустить этот шаг непосредственно в холодильник - 80°C, но выживаемость немного ниже.