Генетически модифицированный положительный клеточный скрининг

ДоговариваемыйОбновление на03/04

Модель

Природа производителя: Производители

Категория продукта

Место происхождения

Онлайн Консультация

Обзор

Генетически отредактированный положительный клеточный скрининг относится к клеткам, которые успешно прошли модификацию целевого гена, идентифицированных и выделенных определенным способом после экспериментов по редактированию генов, таких как CRISPR / Cas9. Обычные методы скрининга включают скрининг антибиотиков (например, с использованием маркеров генов устойчивости), скрининг маркеров флуоресцентных белков, проверку PCR или секвенирования. Этот процесс имеет решающее значение для получения чистой или смешанной мутантной клеточной линии, изучения функции гена или построения модели заболевания.

Подробности о продукте

Генетически модифицированный положительный клеточный скрининг:: Техническая стратегия и оптимизация процессов

Положительный клеточный скрининг является основным звеном в редактировании генов, эффективность которого напрямую влияет на экспериментальный цикл и успешность.

I. Цели и задачи отбора

Основные цели

Выделение успешно отредактированных клеток из гибридной клеточной популяции (например, генетическое выщелачивание / KO, постукивание / KI).
Исключение интерференции клеток дикого типа (когда доля неотредактированных клеток высока, это может легко привести к ложноотрицательным).

Основные проблемы

Клеточное повреждение:: Длительный скрининг приводит к старению клеток (резкое снижение способности к размножению после передачи фибробластов свиней).
Ложный риск:: Частичное редактирование не wan полностью разрушает функцию гена (например, мутация сдвига не приводит к потере функции).
Узкое место в потоке:: Традиционная моноклональная культура занимает более 22 дней и имеет менее 20% положительных результатов.

II. Основные методы отбора и рабочие процессы

i) Технология обогащения на основе систем отчетности

Использование механизмов восстановления для запуска флуоресцентных / резистентных маркеров для визуализации и быстрого разделения:

Механизм восстановления	Разработка системы отчетности	Методы отбора	преимущество	кейс
цифра	Цель - разрушение флуоресцентного белка Конец → Восстановление экспрессии	FACS выделяет клетки GFP	Интуитивно эффективный, для KO	Устройство CRISPR - DIY
HDR	Гетерогенная рекомбинация путем вставки устойчивых генов (например, Puro ᵣ)	Антибиотический стресс скрининг	Подходит для KI, низкая стоимость	Небесные частицы CRISPR
SSA	Одноцепочечный отжиг, вызванный разрывом → восстановление флуоресцентных белков	Поточная цитология	Высокая чувствительность, низкая скорость промаха	Многофакторная проверка редактирования генов

процедура(Пример системы NHEJ - GFP):

Построение содержитКонец GFP - TAAРедактор - носитель (SgRNA - мишень в области TAA).

После транскрипции клеток NHEJ восстанавливает разрушающий концентратор → экспрессию GFP.

Использовать после 72 ч.Поточный цитометр (например, iQue) ®） Выделение клеток GFPА.

(ii) Быстрая идентификация микроклеток

Прорывные программы:: Для завершения идентификации генотипа требуется всего 50 клеток, что сокращает цикл более чем на 15 дней.

Ключевые параметрыА.

Количество клеток:: 50 шт. (недостаточный коэффициент обнаружения 20 групп клеток, p < 0,01).
чувствительность к ферментации:: T7E1 обнаруживает эффективность редактирования на уровне 5%.
Шаги проверки:: Секвенирование Sanger подтверждает тип мутации (например, вставка / отсутствие).

(iii) Технология проверки резания и секвенирования ферментов

метод	принцип	Сфера применения	Ограничения
T7E1 Ферментная резка	Диспропорциональная резка создает гетерогенную двойную цепь	Начальное сито (низкая стоимость)	Низкая чувствительность (≥ 5% редактирования)
Секвенирование Sanger	Прямое чтение последовательности вариаций	Моноклональная проверка	Низкий поток
Секвенирование высокого потока	Мутация в мишени с глубоким покрытием	Многогенный / нецелевый анализ	成本高

Операционная оптимизацияА.

Смешанное клонированное предварительное сито:: FA - PCR обнаруживает частоту группового редактирования, > 30% после разделения моноклонов.

Политика двойной проверки:: T7E1 Положительное клонирование с первичным скринингом → подтверждение секвенирования Sanger (во избежание ложноположительного).

Технический выбор и адаптация сцены

(i) Выбор по типу клетки

Тип клетки	Рекомендуемый метод	Обоснование
Протогенные клетки	Метод микроклеточной идентификации	Избегать долгосрочного культивирования, вызывающего старение (фибробласты свиней)
Линия опухолевых клеток	Скрининг антибиотиков + FACS	Быстрое размножение, устойчивость к лекарствам стабильна.
iPSC	Система отчетности HDR + моноклональное секвенирование	Поддержание многофункциональности требует высокоточного редактирования

(ii) Выбор по типу редактирования

Тип редактирования	Технология фильтрации	Ключевые показатели
Удаление генов (KO)	Система отчетности NHEJ - GFP	Доля клеток GFP ⁺ (количественная величина потока)
Генетический стук (KI)	Скрининг антибиотиков + проверка PCR	Устойчивость выживаемости + усиление фланговой последовательности
Точечные мутации (PM)	T7E1 + Секвенирование глубины	Частота мутации 90%.

Генетически модифицированный положительный клеточный скрининг

Похожий продукт рекомендовать