Эксперимент с медленной вирусной транскрипцией

ДоговариваемыйОбновление на03/04

Модель

Природа производителя: Производители

Категория продукта

Место происхождения

Онлайн Консультация

Обзор

Эксперимент с медленной вирусной транскрипцией - это метод, который использует модифицированный медленный вирусный вектор для стабильного импорта чужеродных генов в клетку - хозяин. Хронические вирусы являются ретровирусами и обладают способностью заражать делящиеся и не делящиеся клетки, интегрируя гены назначения в геном хозяина для достижения долгосрочной стабильной экспрессии. Эта технология широко используется в таких областях, как исследования функции генов, генная терапия и подготовка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS - клеток).

Подробности о продукте

I. СОДЕРЖАНИЕЭксперимент с медленной вирусной транскрипциейТехнические определения и основные ценности

Хроническая вирусная транскрипцияЭто использование модифицированного медленного вирусного носителя для доставки экзогенных генов в клетки - мишени.Долгосрочное стабильное выражениеТехнология генетического импорта. К числу его основных преимуществ относятся:

Применимость клеток широкого спектра:: Может заражать расщепляющиеся клетки и нерасщепляющиеся клетки (например, нейроны, стволовые клетки, протоклетки), нарушая традиционные транскрипционные ограничения.
Эффективное интегрированное выражение:: Вирусные РНК интегрируются в геном хозяина путем обратной транскрипции в ДНК, обеспечивая долгосрочную экспрессию чужеродных генов.
Низкая иммуногенность:: Удаление вирусных патогенных генов (например, ВИЧ)татАрев) Значительно снижает иммунный ответ хозяина.
Оперативная простота:: Нет необходимости в сложном транскрипционном реагенте, который заражает клетки непосредственно через вирусные частицы.

ТерминологияА.

Транскрипция (Transfection):: Импорт нуклеиновых кислот, как правило, относится к неинвирусной опосредованной нуклеиновой кислоте (например, электрическая перфорация, липиды).

Трансдукция (Transduction):: Специально относится к передаче генов, опосредованных вирусами, технология медленных вирусов относится к этой категории.

II.Эксперимент с медленной вирусной транскрипциейМолекулярный механизм: от упаковки вирусов до интеграции генов

(i) Состав системы переносчиков медленных вирусов

компонент	функция	Эволюция технологий
Переносные плазмиды	Носит экзогенные гены (например, cDNA, shRNA) и упаковочные сигналы ()	Удаление носителей третьего поколениятатПереход на транскрипцию с загрузочным подсистемой CMV
Упакованные плазмиды	Выражение вирусных структурных белков (Gag, Pol)	Разделение на две плазмиды: gag / pol и rev, что снижает риск рекомбинации
Белковые гранулы оболочки	Выражение белка VSV - G (G - белка вируса волдыревого стоматита), определяющего диапазон хозяина	Замените естественную оболочку ВИЧ, расширив тип инфицированных клеток
Дополнительные плазмиды	Предоставление белка Rev, который способствует выведению ядра из несвязанной РНК	Увеличение производства вирусов

ii) Процесс доставки генов внутри клетки - хозяина

Вирус проникает:: Белки VSV - G связывают рецепторы мембран - мишеней (например, LDLR), которые являются промежуточными мембранными слияниями.
Ретранскрипция и вход в ядро:: Вирусная РНК ретранслируется в цитоплазме как cDNA и транспортируется в ядро через доинтегрированный комплекс (PIC).
Геномная интеграция:: Вирусный интегративный фермент (Integrase) рандомизирует cDNA в хромосому хозяина для достижения длительной экспрессии yong.

Стандартные рабочие процессы и техническая оптимизация

(i) Упаковка и очистка вирусов (например, 293Т - клеток)

шаг	Оперативные элементы	Стандарты контроля качества
Интерплазмидная транскрипция	Четырехплазмидная система (трансфер + упаковка + оболочка + вспомогательная) транскрипция 293Т - клеток, сбор очищения 48 - 72 часов	Чистота плазмиды > 1.8 (A260 / A280), без эндотоксинов
Концентрация вируса	Превышение центрифуги (50 000 × g) или метод осаждения ПЭГ, увеличение титра в 10 - 100 раз	Концентрированное титрование > 1×10⁸ IFU / mL
титрование	Поточная цитология (флуоресцентная отчетность генов) или qPCR (количество копий вирусного генома)	Функциональное титрование (TU / mL) > 10 ⁷ для соответствия

(2) Транскрипция и скрининг клеток - мишеней

Оптимизация условий зараженияА.

Добавление поликонденсатина (Polybrene, 8 мкг / мл) усиливает адсорбцию вируса.
Инфекционный комплекс (MOI) тест: обычно MOI = 5 - 20 (скорректирован в соответствии с типом клетки).

Стабильный сортировкаА.

Скрининг антибиотиков: пуриномицин (1 мкг / мл) обрабатывается в течение 7 - 14 дней, очищая необработанные клетки.
Моноклональная амплификация: метод ограниченного разбавления для получения однородных штаммов клеток.

Ключевые навыкиА.

Неделящиеся клетки (например, нейроны) должны продлить время заражения до 72 часов.

Протогенные клетки рекомендуют использовать низкий MOI (5), чтобы избежать токсичности.

Похожий продукт рекомендовать